單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)是在單個細(xì)胞水平對mRNA進(jìn)行高通量測序的一項(xiàng)新技術(shù)，原理是將分離的單個細(xì)胞中微量的mRNA通過高效擴(kuò)增后再進(jìn)行高通量測序。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠有效解決組織樣本細(xì)胞異質(zhì)性以及常規(guī)RNA-seq被掩蓋的細(xì)胞群內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的稀有細(xì)胞類型，并深入了解細(xì)胞生長過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
基于10x Genomics最新Chromium系統(tǒng)利用油包水的微反應(yīng)體系，通過序列標(biāo)簽(cell barcode和UMI)區(qū)別群體中的不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄本，獲得單細(xì)胞水平的基因表達(dá)譜，可實(shí)現(xiàn)數(shù)千甚至上萬個單細(xì)胞群體分析，解決常規(guī)scRNA-seq方法在通量或擴(kuò)展性方面存在的不足，為單細(xì)胞研究開拓新的思路。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)優(yōu)勢
通量高，一次可以同時測8個樣本，每個樣本最多可以測10000個細(xì)胞
周期短，6分鐘內(nèi)完成上萬個細(xì)胞封裝，一天之內(nèi)完成細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞捕獲、擴(kuò)增以及建庫
捕獲效率高，單個細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%
應(yīng)用范圍廣，動物細(xì)胞、植物細(xì)胞均可以進(jìn)行單細(xì)胞測序，廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性、免疫細(xì)胞群體檢測以及胚胎發(fā)育等研究
技術(shù)原理
利用8通道的微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)，將含barcode的凝膠珠(Gel Beads)、細(xì)胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs。
GEMs形成后，細(xì)胞裂解，凝膠珠自動溶解釋放大量barcode序列，隨后mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA，再構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)測序文庫。
建庫流程
案例展示
案例一 通過10× genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序繪制肺癌腫瘤微環(huán)境圖譜
Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment
研究背景
腫瘤周圍的組織、免疫細(xì)胞、血管和細(xì)胞外基質(zhì)共同形成的腫瘤微環(huán)境對腫瘤的生長和侵襲至關(guān)重要，本研究試圖通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示肺癌腫瘤微環(huán)境的特征。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
文章共選取5例共19個樣本，通過10×genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序探索基質(zhì)細(xì)胞的亞群分類、基因功能(信號通路)、關(guān)鍵marker基因和臨床預(yù)后。共鑒定出52個基質(zhì)細(xì)胞亞群，反映了腫瘤微環(huán)境復(fù)雜性。對基質(zhì)細(xì)胞的marker基因做生存曲線，發(fā)現(xiàn)這些marker基因可以作為肺癌預(yù)后診斷的潛在標(biāo)志物。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序常見問題
1. 為什么每個樣品需要那么多的細(xì)胞量?
答：細(xì)胞在上機(jī)之前，需要對進(jìn)行一系列的質(zhì)檢，質(zhì)檢過程需要用掉部分細(xì)胞。
2. 如何檢測細(xì)胞活性?
答：可以使用臺盼藍(lán)染色，用顯微鏡觀察細(xì)胞活性。
3. 植物細(xì)胞能做單細(xì)胞測序嗎?
答：植物細(xì)胞可以做單細(xì)胞測序，但需要注意兩點(diǎn)：1. 需要注意細(xì)胞大小，10× genomics的適用對象是直徑小于40 nm的細(xì)胞。2. 植物細(xì)胞含有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁對后續(xù)裂解有影響，所以需要用纖維素酶等消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體。
4. 單細(xì)胞測序需要和常規(guī)轉(zhuǎn)錄組一樣設(shè)置重復(fù)嗎?
答：單細(xì)胞測序的目的是分離群體細(xì)胞中的不同亞群，表征這些亞群的特征，我們建議老師最好有實(shí)驗(yàn)組和對照組，但一般對生物學(xué)重復(fù)沒有要求。
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