流式細胞術(shù)作為一種可在單細胞水平上對大量細胞進行快速、準確、多參數(shù)定量分析和分選的高技術(shù)，在細胞生物學、免疫學、腫瘤學等方面的應(yīng)用日趨廣泛和深入。進行流式細胞術(shù)分析的前提是樣品為單細胞懸液，根據(jù)不同實體組織成分的特點可選擇不同的分散細胞的方法，以期達到單細胞產(chǎn)量高、細胞損傷小的目的。
在實體組織分散為單細胞的過程中，解離的方法有可能瞬間或持久地影響細胞的性質(zhì)，比如，形態(tài)上顯而易見的細胞膜破損，細胞表面上可出現(xiàn)泡狀特征，還有一些是難以觀察到的線粒體活性的變化、選擇性膜表面抗原的丟失、蛋白質(zhì)的丟失等，細胞受損程度受溫度、pH值、處理時間等多種因素的影響。機械性或人工制備的單細胞，在某些性質(zhì)上很可能已改變了原組織細胞特性，因此處理不同組織時，努力摸索方法，盡可能采用對細胞損傷小，產(chǎn)率較高的單細胞懸液制備方法，較大限度地保持細胞原有特性。
目前將組織分離為單個細胞的傳統(tǒng)方法有機械法、酶消化法和化學法等，這些方法沒有統(tǒng)一的標準，且非常浪費時間，獲得的細胞的活性和得率相對低很多，美天旎研發(fā)的gentleMACS組織處理系統(tǒng)結(jié)合機械法和酶消化法，使用自動化方式可以快速溫和、安全、省時、標準化、便捷、自動化的從組織(脾臟，肝臟，肺部，腫瘤，表皮，神經(jīng)組織....)中分離單個細胞懸液，也可將組織塊制備成勻漿(如蛋白提取，核酸提取)。下面介紹幾種溫和組織處理器方法。
(一)酶消化法
酶的作用原理主要有三方面：一是破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等，二是水解組織細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，三是水解組織粘多糖物質(zhì)。酶消化法是實體組織分散為單細胞的主要方法之一。常用的酶類有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、彈性蛋白酶等?？筛鶕?jù)分散的組織類型確定使用的酶類。需要注意的是使用條件和影響因素(酶濃度、酶效價、作用時間、pH值)等，如胃蛋白酶在堿性環(huán)境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。
酶消化法常規(guī)程序如下：
1、將適合于酶消化的組織置于離心管中。
2、將選好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化組織的試管中。
3、常規(guī)消化20～30min(恒溫37℃或室溫)，消化期間間斷振蕩或吹打。
4、終止消化，收集細胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞，以低速離心除去細胞碎片。
5、加入PBS 2ml充分混勻，離心棄掉上清。再加入0.5ml PBS重懸細胞。
6、將制備好的單細胞懸液進行熒光標記后上機檢測或保存?zhèn)溆谩?/span>
(二)機械法
機械法分散實體組織包括：用剪刀剪碎組織或用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，用線注射針頭反復(fù)抽吸細胞等，然后用300目尼龍網(wǎng)過濾細胞得到溫和組織處理器。
1、剪碎法
(1)將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水。
(2)用剪刀將組織剪至勻漿狀。
(3)加入10ml生理鹽水。
(4)用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。
(5)離心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理鹽水洗3次，每次以短時低速(500～800rpm/min)離心沉淀去除細胞碎片。
(6)以300目尼龍網(wǎng)過濾去除細胞。
(7)選擇適當?shù)墓潭ㄒ?70%冰乙醇等)固定細胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br/>
2、網(wǎng)搓法
(1)將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。
(2)把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。
(3)收集細胞懸液，離心沉淀細胞500～800rpm/min，2分鐘。
(4)固定細胞或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。
3、研磨法
(1)先將組織剪碎成1～2mm3小塊。
(2)放入組織研磨器中加入1～2ml生理鹽水。
(3)轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿。
(4)加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器。
(5)收集細胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀細胞，500～800rpm/min，2分鐘，再用生理鹽水洗3遍，離心沉淀。
(6)固定或低溫保存細胞，備用。
(三)化學處理法
化學處理法的主要原理是：將組織細胞間起粘連作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細胞分散下來。
1、溫和組織處理器試劑配制
(1)0.2%EDTA配制：將0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中，封裝高壓消毒，置0～4℃保存。
(2)胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml，濃度為0.125%，EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml，濃度為0.2%。各取40ml混合，分裝后置0～4℃冰箱保存，使用前過濾即可使用。
2、實驗方法
(1)將組織切成薄片，置于試管。
(2)首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5小時，離心棄之。
(3)加入胰酶-EDTA液5～10ml，置37℃恒溫水浴30min，間斷振蕩3～5次。
(4)用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000rpm/min，5分鐘。再以生理鹽水洗2～3次，離心500～800rpm，1～2分鐘。
(5)將細胞固定或低溫保存?zhèn)溆?/span>溫和組織處理器。
化學處理法獲得的細胞存活率低，細胞產(chǎn)量較低，細胞碎片和細胞聚集量不穩(wěn)定。
(四)美天旎組織解離系統(tǒng)
1、使用方法：將20~4000mg大小樣本或0.3~10ml樣本與組織所對應(yīng)得解離試劑盒共同加入至組織解離管并旋緊管蓋;把解離管安裝至gentleMACS溫和組織處理器上，啟動程序并運行，得到溫和組織處理器或亞細胞結(jié)構(gòu)。
2、適用組織：
(1) 制備溫和組織處理器
● 人類或小鼠的腫瘤組織
● 小鼠或大鼠的新生心臟組織
● 神經(jīng)組織
● 小鼠的脾臟，肺，固有膜，肌肉，上皮組織，肝臟
● 人類或小鼠的皮膚等
(2)制備組織勻漿
● 從新鮮或凍存樣本中提取DNA，RNA
● 提取蛋白
● 分離細胞器
● 測定病原菌滴度等
3、產(chǎn)品特點
(1)溫和有效：
gentleMACS使用專門的一次性分離管(C管和M管)，管蓋上帶有特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)子和定子，對樣本減少損傷，保證了細胞活性，同時得到了高回收率。
(2)一個機器支持多種用途：
生成溫和組織處理器和制備亞細胞物質(zhì)。C管可以得到單細胞懸液，用于細胞分選，分析或者是培養(yǎng)。M管可以將組織和細胞勻漿，用于分離亞細胞物質(zhì)(如蛋白，核酸)。
(3)無菌分離：
C管和M管的中間都有一個用隔膜封閉的小孔，能保證在無菌條件下，在封閉系統(tǒng)中安全地處理樣品。
(4)用戶安全：
針對一些感染性樣本處理采用封閉系統(tǒng)處理，比如細菌病原感染的樣本，完全不需要打開試管蓋，即可添加酶以及其他溶液，或者取出分離出來的細胞或者勻漿溶液，保護實驗室操作人員安全。
(5)全自動和標準化：
自動標準化程序已經(jīng)設(shè)置好時間，速度和操作方向，只要將樣本材料和適合的溶液(如緩沖液，培養(yǎng)基等等)加入試管內(nèi)，把試管頭朝下安裝即可運行程序。
(6)結(jié)果可靠：
標準化流程操作，減少人為操作誤差，使結(jié)果有高度可重復(fù)性。
(7)便捷靈活：
超凈臺上即可操作，方便安裝。儀器樣本容量靈活(0.3~10ml)，標本大小20~4000mg。
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