多細(xì)胞生物的每個(gè)細(xì)胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過(guò),近年來(lái)蓬勃發(fā)展的單細(xì)胞研究告訴我們,每一個(gè)細(xì)胞都是獨(dú)特的。The Scientist雜志近聯(lián)系了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家,請(qǐng)他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫(kù),處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
那么,細(xì)胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義,哪些差異來(lái)自于技術(shù)偏好呢?要獲得可靠的結(jié)果又需要研究多少細(xì)胞呢?這些問(wèn)題曾經(jīng)是單細(xì)胞研究(尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究)的攔路虎,令人望而卻步。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。
The Scientist雜志近聯(lián)系了單細(xì)胞研究領(lǐng)域的一些專家,請(qǐng)他們分享了在單細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫(kù),處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
測(cè)序方法大比拼
在單細(xì)胞研究的大潮中,新的測(cè)序方法層出不窮。不過(guò),很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enard近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì),在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序方法,包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART(Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)。實(shí)際上,能夠從單細(xì)胞生成全長(zhǎng)cDNA的測(cè)序方案并不多,Smartseq就是其中之一。對(duì)于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來(lái)說(shuō),覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去,儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞,把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來(lái)測(cè)序,也可以進(jìn)行qPCR檢測(cè)。
在Enard的比較研究中,F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq為靈敏,成本也高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用,不過(guò)這種芯片可以放到顯微鏡下觀察,證實(shí)健康單細(xì)胞的存在。
斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團(tuán)隊(duì)利用Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng),對(duì)人類大腦皮層的482個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,終得到了466個(gè)單細(xì)胞的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明,單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及血管細(xì)胞,還能將神經(jīng)元分為五類興奮性細(xì)胞和兩類抑制性細(xì)胞。
CEL-seq
CEL-seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)是一種采用線性擴(kuò)增的常用測(cè)序方法。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)是錯(cuò)誤率比較低,不過(guò)線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年,主要是分離單細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段,給它們貼上代表其細(xì)胞來(lái)源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫(kù)花費(fèi)的時(shí)間要稍微長(zhǎng)一點(diǎn)。不過(guò),CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合,大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間。PCR是在后階段使用的,主要是為了連接正確的測(cè)序接頭。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的,大約兩天時(shí)間生成測(cè)序文庫(kù)和測(cè)序數(shù)據(jù),Yanai指出。需要注意的是,CEL-seq與大多數(shù)方案一樣,測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的3’ 端。Enard等人只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項(xiàng)研究來(lái)看,CEL-seq的重現(xiàn)性好。GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學(xué)工具。Yanai研究團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)新版本CELseq2,新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq(single-cell RNA barcoding and sequencing)技術(shù)采用的是PCR擴(kuò)增。該技術(shù)需要結(jié)合流式細(xì)胞儀(FACS)或者其他細(xì)胞分選方法,把單細(xì)胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似,只不過(guò)SCRB-seq會(huì)整合特異性的細(xì)胞條碼,以分辨擴(kuò)增分子的來(lái)源,更準(zhǔn)確的定量轉(zhuǎn)錄本。此外,SCRB-seq并不生成全長(zhǎng)cDNA,而是像CELseq一樣富集RNA3’端。
據(jù)說(shuō)Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard中意的測(cè)序方法,它不僅適用于單細(xì)胞RNA測(cè)序,還能支持大量細(xì)胞(bulk)的RNA測(cè)序??上У氖荢CRB-seq并不好DIY,研究者自己很難將測(cè)序流程與FACS對(duì)接起來(lái)。
目前,在單細(xì)胞中揭示DNA甲基化與基因表達(dá)的直接關(guān)聯(lián)還比較困難。這是因?yàn)榧?xì)胞之間存在較大的差異,又不能同時(shí)檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。加州大學(xué)范國(guó)平教授和同濟(jì)大學(xué)薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開發(fā)的新單細(xì)胞測(cè)序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。