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     單細胞生物學(xué)近幾年是非常熱門的研究方向。在這一實驗領(lǐng)域中的則是單細胞測序技術(shù)。傳統(tǒng)測序方法一次處理成千上萬個細胞，得到的變異水平也是成千上萬個細胞的平均后水平。但是，就如同世界上沒有完全相同的兩片樹葉一樣，沒有兩個細胞是完全相同的。所以，單細胞測序?qū)τ谘芯繂蝹€細胞就顯得至關(guān)重要。

     單細胞測序可以揭示出每個細胞獨特的微妙變化，甚至可以揭示全新的細胞類型。單細胞測序技術(shù)可謂是科技發(fā)展史上的一大創(chuàng)舉，它推進了基因組學(xué)領(lǐng)域，使不同細胞類型得以精細區(qū)分，使得科學(xué)家們在單細胞水平進行分子機制研究成為可能。

      隨著高通量RNA測序技術(shù)的發(fā)展，2009年，開發(fā)了一個單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。到了2011年Nicholas等人開發(fā)了單細胞基因組測序技術(shù)。2013年又開發(fā)出了單細胞全基因組DNA甲基化檢測技術(shù)。隨后，科學(xué)家在細胞分選技術(shù)、核酸擴增技術(shù)、信噪比提高方面等進行不斷優(yōu)化和改進，也進一步開創(chuàng)了單細胞Hi-C、單細胞ChIP-seq、單細胞ATAC-seq技術(shù)等。

      2017年單細胞測序在技術(shù)水平和應(yīng)用層面上都更進一步發(fā)展，本周我們匯總了2017年單細胞測序技術(shù)層面的部分重要進展。

SCI-seq

     2017年3月，美國俄勒岡的研究人員在Nature Methods上發(fā)表“Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing (doi:10.1038/nmeth.4154) ”文章，開發(fā)出一種SCI-seq (single-cell combinatorial indexed sequencing，單細胞組合標記測序技術(shù))，多次對細胞進行條形碼編碼標記后對它們進行測序，可以同時構(gòu)建上千個單細胞文庫，檢測體細胞拷貝數(shù)的變異。這項技術(shù)縮減了文庫構(gòu)建的成本，增加了檢測細胞的數(shù)量，這對于體細胞變異的檢測，尤其是在腫瘤進化過程中對細胞亞克隆變異研究具有重要價值。研究人員從培養(yǎng)的細胞系、靈長類額葉皮層組織和兩個人類胰腺癌中構(gòu)建了大約17000個單細胞基因組文庫，這大約比利用常規(guī)方法能夠構(gòu)建出的基因組文庫大小高出兩個數(shù)量級。 

      2017年4月北京大學(xué)謝曉亮教授團隊在Science上發(fā)表“Single-Cell Whole Genome Analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI) (doi: 10.1126/science.aak9787)”文章，開發(fā)一種新型的單細胞全基因組線性擴增的方法——;LIANTI（Linear Amplification with Transposon Insertion）用于單細胞全基因組測序。

      LIANTI法通過轉(zhuǎn)座子插入進行線性放大?；蚪M被含有T7啟動子的Tn5轉(zhuǎn)座子隨機片段化 ，T7啟動子允許線性擴增。LIANTI法測量拷貝數(shù)的空間分辨率提高了３個數(shù)量級（能在千堿基分辨率進行微小CNV檢測，基因組覆蓋率可達到97%)，能直接觀察從細胞到細胞不同的隨機發(fā)生的DNA復(fù)制起始位點。他們用新方法檢測了被紫外線照射過的單個人類細胞的單核苷酸突變，結(jié)果明顯優(yōu)于目前已知的其他方法。這意味LIANTI能更有效、準確地檢測出更多疾病突變。
 

CROP-seq

     2017年7月，奧地利研究人員在Nature Methods上發(fā)表“Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout (doi:10.1038/ nmeth.4227)”文章，創(chuàng)造性地將CRISPR-Cas9和單細胞RNA測序兩種較有前景的基因組學(xué)領(lǐng)域結(jié)合在一起，發(fā)明了這種被稱作CROP-seq的單細胞測序方法 (CRISPR droplet sequencing， CRISPR液滴測序), 能大規(guī)模完成的高通量基因調(diào)控的分析。

     團隊首先結(jié)合了CRISPR集中篩選和按序篩選的優(yōu)勢，構(gòu)建出一種能夠幫助研究人員看到單細胞測序?qū)嶒灥腃RISPR gRNAs的病毒載體， 再結(jié)合新的用于單細胞RNA測序的液滴方法足以高通量地分析單個細胞中上千種基因組編輯事件的影響。隨著單細胞測序成本的下降，這種方法能夠產(chǎn)生首批人類基因組上2.3萬個基因中每個基因的調(diào)節(jié)影響的綜合圖譜。
   

scCOOL-seq

2017年8月，北京大學(xué)湯富酬教授團隊在Cell Research 上發(fā)表 “Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells (doi: 10.1038/cr.2017.82)”文章，開發(fā)了一種單細胞多重測序技術(shù) (scCOOL-seq)，可以對一個單細胞同時分析染色質(zhì)狀態(tài)/核小體定位、DNA甲基化、基因組拷貝數(shù)變異和染色體倍性倍性。并采用這一技術(shù)在單細胞分辨率上系統(tǒng)、深入地解析了小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中表觀基因組重編程的關(guān)鍵特征，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的互動關(guān)系。這是一次在單細胞內(nèi)對同一個單細胞進行多達5個層面的基因組和表觀基因組特征的分析，突出了DNA甲基化和染色質(zhì)狀態(tài)的不同模式和功能。
 

      考慮到單細胞表觀基因組測序技術(shù)的相對低的覆蓋率，理想的狀態(tài)是明確地區(qū)分染色質(zhì)狀態(tài)，包括閉合狀態(tài)和未檢出的狀態(tài)。scCOOL-seq這一新技術(shù)是可以實現(xiàn)這一點的單細胞染色質(zhì)測序方法。此外，scCOOL-seq可以同時檢測同一個體細胞中染色質(zhì)狀態(tài)、核小體定位、內(nèi)源DNA甲基化、CNV倍性，這將大大增強單個細胞內(nèi)不同遺傳和表觀遺傳層之間的復(fù)雜關(guān)系的分析能力，為今后人們繼續(xù)研究哺乳動物早期胚胎細胞全能性和多能性的開啟奠定了基礎(chǔ)，同時為體細胞克隆效率的提高以及早期胚胎發(fā)育異常的診斷與治療提供了新思路。

DroNC-seq

      10月，Broad研究所張鋒教授團隊在Nature Methods上發(fā)表題為“Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq with DroNc-Seq (doi: 10.1038/nmeth.4407)” 的文章，提出了一個新的測序技術(shù)：DroNc-Seq單細胞表達譜分析技術(shù)。該技術(shù)混合了sNuc-Seq技術(shù)與微流控技術(shù)的單細胞核RNA測序方法，可以在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織中更有效地分析大量細胞或細胞核中的RNA，開啟單細胞核測序的規(guī)模化時代。
   

      在利用單細胞技術(shù)來研究大腦等復(fù)雜組織的基因表達時，研究人員總會覺得困難重重，因為復(fù)雜組織不易分離，難以辨別，分離細胞的過程會經(jīng)常破壞目的神經(jīng)元和RNA。sNuc-seq則利用單個提取的細胞核作為起始材料，通過觀察細胞核去理解不同的細胞類型和動態(tài)過程，如神經(jīng)的形成。但sNuc-Seq是一種低通量的技術(shù)，其應(yīng)用規(guī)模受到了限制。為擴大研究的應(yīng)用規(guī)模，實現(xiàn)一次可研究數(shù)千個細胞核的高效測序，研究團隊將目光轉(zhuǎn)向了Drop-Seq。它將單細胞與帶有DNA條碼的微珠一起包裹在微滴中，大大加速表達譜分析實驗，同時降低成本。他們開發(fā)出了混合了兩種技術(shù)的DroNc-Seq方法。為檢驗方法的準確性與效率，研究人員利用DroNc-Seq對小鼠細胞系和腦組織進行了分析，并與Drop-Seq、sNuc-Seq以及其他較低通量的單細胞RNA-Seq方法進行比較。結(jié)果顯示DroNc-Seq表現(xiàn)出了靈敏、高效且無偏向的細胞分類能力。該技術(shù)很可能用于人體細胞圖譜計劃項目。

SISSOR

      11月加州大學(xué)圣地亞哥分校張鹍教授團隊在PNAS上發(fā)表題為“Ultra-accurate Genome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells (doi: 10.1073/pnas. 1707609114)”的文章。開發(fā)了一個名為“SISSOR” (微流體反應(yīng)器法單鏈測序)的方法，用來進行準確的單細胞基因組測序和單倍體分型。

      正常人類單個細胞DNA含量為6.6pg，相對于測序所需的ug級相當微量，并且有些DNA是獨特的，因此單細胞測序的關(guān)鍵一環(huán)是全基因組擴增(WGA)，常見的方法如，MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶對細胞基因組做大量的體外擴增，然后構(gòu)建文庫進行相對讀長較短的高通量測序。這些方法有兩個明顯的缺點：1，聚合酶的錯誤擴增可以在基因組上產(chǎn)生成千上萬的假陽性。2，短的序列讀長幾乎不包含任何單倍體類型信息。

      SISSOR方法是利用微流體處理器將單個細胞染色體DNA的正負雙鏈進行分離，并將百萬堿基大小的DNA片段隨機分割成大量的納升級的組分，用于擴增和構(gòu)建測序文庫，從而實現(xiàn)對同源染色體的互補雙鏈分別進行獨立的測序。這樣就能夠進行Long-range單倍體的組裝，并且還能利用冗余和單倍體型信息糾正測序錯誤。結(jié)果顯示，該方法的糾錯能力可以將單細胞測序錯誤率降低至10-8，并且單倍體片段平均可組裝長度為500 kb，contig達到N50大于7 Mb。該方法能夠準確獲得單細胞基因組序列以及單倍體信息以滿足臨床對基因組測序的不同需求。SISSOR是對單細胞測序技術(shù)的一次突破，將測序準確性提高了兩個數(shù)量級。這項技術(shù)潛在的應(yīng)用包括對患者血液中循環(huán)腫瘤細胞進行準確的檢測，以及對體外受精的健康胚胎進行篩選和檢測經(jīng)過基因編輯的人體細胞。

snDrop-seq+scTHS-seq

       張鹍教授團隊本月又在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了“Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain (doi: 10.1038/nbt.4038)”的文章。開發(fā)了基于冰凍組織高通量單細胞核測序方法來繪制成年人腦第二代單細胞圖譜，再次引爆了單細胞研究的熱點。

      研究人員將視線聚焦于腦組織提取的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞單細胞核，克服了樣本的限制，使該方法可以應(yīng)用于新鮮或凍存的腦組織，實現(xiàn)了凍存組織的大規(guī)模單細胞檢測。另外，這項研究的一個創(chuàng)新之處在于結(jié)合了兩種高通量單細胞技術(shù)：基于微流體的單核測序 (snDrop-seq) 和單細胞轉(zhuǎn)座子超敏感位點測序 (scTHS-seq)的方法。snDrop-seq，不僅可以對成千上萬個單細胞同時進行轉(zhuǎn)錄組分析，從多方面對細胞類型和細胞狀態(tài)進行分類，還可用于評估新鮮和凍存人體組織中的特異性表達譜，有助于研究組織的功能異質(zhì)性。該技術(shù)還攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過度降解的難題。為同時研究表觀遺傳特征，該團隊還開發(fā)了scTHS-seq技術(shù)。scTHS-seq擁有具有體外轉(zhuǎn)錄擴增的線性優(yōu)勢和改造后的突變Tn5轉(zhuǎn)座酶，比ATAC-seq靈敏度更高，還提高了高度細胞特異性的遠端增強子(distal enhancers)的覆蓋度。

      研究團隊聯(lián)合應(yīng)用以上兩種方法建立了這種可并行檢測細胞核轉(zhuǎn)錄本和表觀遺傳特征的高通量測序平臺，為綜合分析凍存人體組織樣本中基因表達和調(diào)節(jié)提供了途徑。研究人員用此方法檢測了超過60,000個來自成人大腦皮層和小腦的單細胞，發(fā)現(xiàn)了35種不同的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型。此外他們還將常見的人腦遺傳疾病相關(guān)的遺傳位點定位到特定的細胞類型，揭示了大腦中哪些細胞類型更易受腦部疾病遺傳因子的影響。這些發(fā)現(xiàn)有助于確定大腦中哪種類型的細胞容易受到遺傳風(fēng)險因子的攻擊，繪制了一個完整的人腦細胞圖譜。

TSCS

     本月，美國安德森癌癥中心的研究人員在Cell上發(fā)表”Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing (doi:10.1016/

j.cell.2017.12.007)” 的研究性文章，發(fā)明了一種新的“地形”單細胞測序技術(shù) (Topographic Single Cell Sequencing, TSCS)來研究細胞位置的空間信息，用于研究早期乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌 (DCIS)是如何發(fā)展為更具有侵襲性的導(dǎo)管癌癥 (IDC)。

     腫瘤細胞往往存在著各不相同的遺傳特征，這被稱為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。它們獨特的細胞構(gòu)成使得治療變得更加困難。此前的單細胞DNA測序方法已經(jīng)打開了探索腫瘤細胞的大門，成為了理解腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的有力工具，但是這種方法能夠去除關(guān)于個體腫瘤細胞在組織內(nèi)準確空間定位的信息。而細胞空間數(shù)據(jù)對于了解腫瘤細胞的遷移至關(guān)重要。研究人員開發(fā)的新工具：“地形”單細胞測序 (TSCS) ，該方法提供了有關(guān)細胞位置的空間信息，能更準確地從空間上測量和描述單個腫瘤細胞的具體特征。這代表了一個技術(shù)上的里程碑，此前的技術(shù)只能采用失去了空間信息的懸浮細胞。
 

       研究人員利用TSCS對來自10位具有DCIS和IDC的患者的1293個單細胞進行了分析。研究數(shù)據(jù)揭示了DCIS和IDC之間的直接基因組譜系，并進一步指出了入侵之前，在導(dǎo)管內(nèi)發(fā)生的大多數(shù)突變和DNA拷貝數(shù)畸變。表明多個癌細胞克隆可以從導(dǎo)管共同遷移到相鄰區(qū)域，形成侵入性腫瘤。

       TSCS和其他類似的單細胞測序方法在開發(fā)早期癌癥研究新途徑方面具有巨大的潛力。希望這些研究未來能揭示為何一些惡性腫瘤前癌沒有發(fā)展成惡性腫瘤，而另外一些則形成了侵入形式。

       隨著前不久前“人類細胞圖譜”計劃的開展，單細胞測序的研究熱情必然持續(xù)高漲。這些單細胞測序技術(shù)的不斷更新和發(fā)展無疑為構(gòu)建完整細胞圖譜提供了技術(shù)基礎(chǔ)。我們可以預(yù)見，未來綜合多組學(xué)的方法必將在復(fù)雜器官和組織的單細胞研究中發(fā)揮愈發(fā)強大的作用。